A l'âge de 15 ans, une vision lui fait comprendre sa mission : il aura à combattre l'esprit du mal. Francesco chérissait le rêve de donner sa vie au Seigneur.
Ce grand désir se réalisa quand, à l’âge de seize ans, il fut admis comme clerc dans l’Ordre des Capucins.
Le 22 janvier 1903, il entre au noviciat des Capucins de Morcone, et prend le nom de Frère Pio da Pietrelcina. Il poursuit sa formation, "novice exemplaire, ponctuel dans l'observance de tout."
Il prononce ses premiers voeux l'année suivante, et ses voeux solennels quatre ans plus tard, le 27 janvier 1907, "à la seule fin de tendre au bien de son âme et de se consacrer totalement à Dieu", selon le document officiel.
Après les premiers voeux ont commencé les études dans différents couvents : rhétorique à Sant'Elia a Pianisi (1904-1905), philosophie à San Marco la Catola (1905-1906) et Sant'Elia a Pianisi (1906-1907), théologie à Serracapriola (1907-1908), Montefusco (1908-1909) et Gesualdo (fin 1909).
Fra Pio reçoit les ordres mineurs (19 décembre 1908) et le sous-diaconat (21 décembre 1908) à Benevento ; il est ordonné diacre dans l'église conventuelle de Morcone le 18 juillet 1909.
A la mi-mai 1909, Fra Pio avait dû interrompre ses études en raison de sa santé, et ses supérieurs l'envoyèrent se reposer dans sa famille à Pietrelcina. Il y demeurera jusqu'au 17 février 1916.
A Pietrelcina, il aide le curé, mais il doit surtout lutter contre sa mystérieuse maladie. Il mène une vie d'ascèse et de prière intenses, où il vit une purification spirituelle radicale. Ce sont des années de correspondance assidue avec le Père Agostino, son directeur spirituel, et le Père Benedetto, le provincial des capucins de Foggia.
Tout au long de cette période, Padre Pio commençait sa journée très tôt, s’éveillant à l’aube pour lire le bréviaire. Puis il descendait à l’église pour célébrer l’Eucharistie, après laquelle il faisait action de grâces devant le Saint Sacrement. Ses journées se partageaient entre l’oraison et la confession.
Il est ordonné prêtre le 10 août 1910, dans une chapelle de la cathédrale de Benevento. Il célèbre sa première messe à Pietrelcina le 14 août.
Ainsi commença sa vie sacerdotale mais, en raison d’une santé plutôt fragile, il séjourna en divers couvents du sud de l’Italie.
A la mi-octobre 1911, il essaie de vivre au couvent de Venafro, où il est soumis à d'incessantes vexations diaboliques et à un redoublement de sa maladie. Il retourne vite à Pietrelcina.
Le 5 mars 1915, il obtient une permission du Saint-Siège de vivre hors d'un couvent pour se soigner. C'est une solution moyenne, alors qu'a été envisagée un moment sa sortie de l'ordre, en raison de cette incapacité de vivre avec ses frères.
Ce n’est qu’à partir du 4 septembre 1916 qu’il fut établi au couvent de San Giovanni Rotondo, sur le Gargano, où il resta, hors quelques brefs et rares voyages, jusqu’à sa mort, le 23 septembre 1968.
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